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PCR基因扩增检验实验室整体解决方案

caclp 2020-10-29 16:09:47 显示全部楼层 阅读模式 打印 上一主题 下一主题
临床基因扩增实验又称 PCR实验,是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法,测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。

与PCR实验室建设相关的指导文件主要有四份:

《医疗机构管理条例》
《医疗机构临床实验室管理办法
《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》
《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》


文件要求临床PCR实验室,不但在实验室设置及仪器设备等硬件上要满足开展临床检验的条件,而且要求实验室在日常工作要有文件化的工作程序。


PCR实验室主要设备


试剂准备区:仪器设备主要有冰箱、超净台、加样器、混匀器、天平等。加样器、天平除了要专用外,还应有定期校准。试剂分装应在超净台中进行,扩增反应混合液应使用分子生物学级的,试剂制备好后应有质检:一是否有污染、二是检测试剂的扩增效果。

样本制备区 :仪器设备主要有生物安全柜、核酸提取仪、加样器、离心机、温育仪、混匀器等 。

扩增区:主要仪器是荧光定量仪、超净台、微量加样器、离心机、可移动紫外灯,扩增仪需进行校准。并配备UPS电源,以防止由于电压的波动,停电对扩增效果的影响。

分析区 :本区所使用的仪器设备有分子杂交仪、酶标仪、测序仪、电泳仪、凝胶成像仪等。
备注:一般实验室可不配备测序仪。




实验室设计的核心问题是什么?


标准的PCR 实验室分为四个区域,分别为:
n1.试剂配制区;
n2.样本制备区;
n3.核酸扩增区;
n4.产物分析区;

这四个区域在物理空间上必须完全相互独立,各区域无论是在空间上还是在使用中,应当始终处于完全的分隔状态,不能有空气的直接相通。

微信截图_20201029160929.png

根据使用仪器的功能,区域可以适当合并。每个区域间设置传递窗,要求一侧打开时另一侧无法打开。4个区域应设置独立的缓冲间,应设置可以通到四个操作区域的PCR走廊,在进入各区域前,应设置更衣间,每个区域的衣服可用不同颜色进行区分,在清洁区应设置洗澡间、卫生间、值班室。还应考虑到医废和标本的运送通道。

实验室的平面布局、空调通风 系统设计、气流控制等都是围绕同一个核心问题进行——“避免污染”,任何级别的医院在建设PCR实验室时,均需要提前考量各个因素,以保证标本的全环节质量及实验室的生物安全。
  • 建设要求。PCR实验室的建设需要设置标准的“四区”:试剂准备区、标本制备区、PCR扩增检测区和扩增产物检测区。每个独立实验区设置有缓冲区,各区通过气压调节,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染,并降低扩增产物对人员和环境的污染。
  • 人员要求。进入PCR实验室,需要经过从基础理论、实验原理、规范操作、质量保证到注意事项等规范的培训,并获取PCR上岗证。
  • 检测风险。检测过程中,样本的开盖,核酸提取的震荡、离心都有可能产生气溶胶,有感染的风险。
  • 防护要求。必须按照生物安全三级实验室的个人防护要求进行。




PCR实验室的空气流向管理



临床基因扩增检验实验室的空气流向应按:试剂准备区→标本制备区→扩增区→产物检测区,应时刻防止扩增产物顺空气气流进入扩增前区域。可按照上述顺序区域空气压力递减的方式进行,可选择负压排风装置,核心区域相对于相邻区域最小压不小于-10Pa。也可通过安装排气扇或者其他方式实现。PCR实验室要求温度18~26℃,相对湿度30%~70%。

PCR实验室并没有严格的净化要求,但是为了避免各个实验区域间交叉感染的可能性,通风方式应为机械通风,不应自然通风,且不宜使用循环风。同时要严格控制送、排风比例以保证各试验区的压力要求。



PCR实验的污染来源都有哪些?



  • 样本间交叉污染:收集样本的容器被污染或样本密封不严导致外溢;不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖;移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌;不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散,相互交叉污染。
  • 实验试剂污染:主要是在 PCR 组分试剂加样过程中,由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。加样过程中,因为PCR试剂对温度十分敏感,需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板/管处于0℃,但这个过程也充满污染风险。
  • 扩增产物污染:大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖,这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大,远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。
  • 克隆质粒污染:作为阳性质控品的克隆质粒外溢。



防止实验污染都有哪些措施?



对于低流行地区,PCR检测人员经过严格培训上岗后,核酸污染的风险相对较小,但在疫区超负荷工作时,就可能会遇到核酸污染的问题,可通过以下措施降低污染机会:
  • 正确佩戴手套:手套未紧密贴合拇指、食指和中指,在进行开盖操作时容易发生交叉污染。
  • 正确使用生物安全柜:简单、整洁、避免通风口堵塞;操作前后紫外线照射,消毒剂随手可及;废液缸里有1/3体积的含氯消毒液,并且及时清理废液缸,保证废物不超过废液缸体积的2/3。
  • 核酸提取仪去污染:每天多批次检测时,在每一批次检测完以后必须用75%的乙醇和核酸去除剂对仪器进行去污染。
  • 重视通风:不定期对房间进行通风,每次至少持续30min。
  • PCR扩增区去污染:PCR反应管必须盖紧,避免扩增后的核酸对环境的污染。
  • 实验室随手可及的消毒剂。

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