请选择 进入手机版 | 继续访问电脑版
 找回密码
 立即注册
  • QQ空间
  • 回复
  • 收藏

IVD原料 | 心肌肌钙蛋白cTn、纤维蛋白原Fg

caclp 2019-12-30 15:37:10 显示全部楼层 阅读模式 打印 上一主题 下一主题
IVD原料:心肌肌钙蛋白cTn
1.gif

心肌肌钙蛋白(cTn)测定的灵敏度已经越来越高,cTn 已被添加到心血管事件风险的首选预测指标之列。cTn 水平与患者短期死亡率、血流动力学稳定患者的突发死亡率相关。需要在不同地区进行前瞻性调查研究来确定cTn 在不同患者中升高的潜在作用及其指导治疗的预后价值。
2.jpg
心肌肌钙蛋白(cTn)是由心肌肌钙蛋白T cTnT),心肌肌钙蛋白I cTnI)和肌钙蛋白CTnC这三种不同基因的亚基组成的调节肌肉收缩的蛋白,也是一种多肽。由钙介导的肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互反应受之调节。由于骨骼肌和心肌中的TnC 具有很高的同源性,因此心肌TnC 不具有心肌组织特异性,而心肌组织中只有cTnIcTnT 具有心肌组织特异性

所以,目前用于临床实验室诊断的是cTnI 和cTnT。欧洲心脏病学会(ESC)、美国心脏病学会基金会(ACCF)、美国心脏协会(AHA)和世界心脏联盟(WHF)自2000 年以来先后发布的3 个版本“心肌梗死统一定义” 中均推荐将cTn 作为临床诊断急性心肌梗死(AMI)的首选血清生物标志物,而该指南历次版本的修订也基本围绕cTn 检测技术的不断更新发展而做出。随着检测技术的进步,cTn 的诊断值定义为超过99%的正常人群的上限,而采用更灵敏的方法检测的高灵敏度cTn 已能放大10 倍检测较低浓度肌钙蛋白,在预防和管理无症状心血管疾病方面的潜在价值已经使cTn 在众多检验指标中脱颖而出。
3.jpg
1、 cTn 的生物学特性

cTnT分子具有稳定,亲水的特点,且特异性抗原决定簇的反应性好。大部分的cTnT 是以C-T-I 的复合物形式存在于心肌肌原纤维中的细肌丝上,心肌细胞浆中存在6%~8%的游离形式。cTnI 是以cTnI-C-T 复合物和游离cTnI 的形式存在于心肌细胞中。由于基因编码的不同,骨骼肌型的氨基酸序列相较于cTnT 和cTnI 都有40%的不同源性。且人的cTnI 氨基酸末端比骨骼肌肌钙蛋白I (sTnI)多31 个氨基酸,这种独特的序列使之具有较高的心肌特异性,有助于制备相应的单克隆抗体。在无心肌损伤时,cTn 在人体血液中的含量甚微,因此在微小心肌损伤的诊断上cTn 超越了传统的酶学指标。
4.jpg

2 、cTn 的实验室检测方法

临床实验室的cTnT 和cTnI 测定主要采用化学发光和电化学发光的方法。cTn 的正常值定义为低于99%正常人群的上限,肌钙蛋白的第99 百分位数一直是诊断AMI 的实验室决定点,但传统去除异常值的统计学处理方法显著改变了肌钙蛋白的第99 百分位数,最近Hickman 等提出了重新确定关于删除异常值确定肌钙蛋白参考区间的程序指南。目前,由于cTn 检测技术的不精确或检测血样浓度过低,部分人群其cTn 的值超过正常值99%的上限仍未能被检测出。Panteghini 等就曾报道过cTn 的检测没有达到制造商规定的变异系数(CV)值≤ 10%的要求。随着人们对低水平cTn 与心血管疾病关系的认识,这些测定方法已无法满足临床的需求。为了达到其CV 值≤ 10%的要求,研究人员已经改良更新了现有cTn 的检测方法,测量值浓度由ng/ml 发展为pg/ml。WANG L 等开发的时间分辨荧光免疫分析检测心肌肌钙蛋白,对于肌钙蛋白检测的灵敏度为2.21pg/ml(线性动态范围为3.24 ~ 963.71pg/ml),平均回收率为100.57%,本发明在临床样品分析中具有高灵敏度,特异性和准确性。cTn 的高灵敏度测定法的发展对慢性心肌损伤的原因和结局提供了巨大洞察机会,并且可以指导改善高风险的心血管疾病门诊患者的治疗。据报道,第4 代cTn 的检测工艺改进后,高敏肌钙蛋白T (hsTnT)检测抗体基因改用人的IgGC1 区域替代鼠单克隆抗体C1 区域,减少嗜异性抗体干扰使其成为检测心肌细胞坏死的最佳指标。
5.jpg

3、 cTn 在多临床学科的应用

3.1 cTn 在心血管医学
2015年公布的《中国心血管报告2015》中指出,随着市场经济的发展,我国人民的生活方式发生了很大变化,人口老龄化和社会城镇化进程都导致了心血管病的发病人数持续增加。据悉,中国现有心血管疾病(包括冠心病、脑卒中、心衰、高血压)患者约2.9 亿人,并呈快速增长趋势。另据了解,在我国每5 例死亡病例中就有2 例死于心血管病,而发病急,致死率高的AMI 在心血管疾病中占据重要地位。近年来,心肌标志物cTnT 和cTnI 的检测已经成为急诊胸痛、心肌损伤和心肌梗死(MI)的临床应用最广泛的诊断依据,特别是对AMI 的早期诊断和及时再灌注治疗,为降低死亡率的关键。在AMI 组中,CK-MB 与Mb 和cTnI 水平呈现显著正相关(r=0.537,0.226 )。同时,组合检测的灵敏度提高到92.79%。CK-MB,Mb,cTnI 和血浆NT-proBNP 水平的联合检测有助于AMI 的早期诊断,从而降低急性期AMI 的死亡率。cTn 的测定值在AMI 的分型上表现出明显的差异性,分析发现无论测量类型和灵敏度,1 型MI 比2型MI 的cTnT 值高32%,1 型MI 比2 型MI 的cTnI 值高91%。此外,在AMI 后,更高的cTn 浓度与预测患者未来不良事件(包括急性失代偿性心力衰竭和慢性心力衰竭)的发生率和死亡率相关联,当cTn 浓度使用新的高灵敏度肌钙蛋白实验方法测量时,超敏心肌肌钙蛋白(hscTn)与此类事件的预后相关性更为明显。并且在多种由非急性冠脉综合征引起的急、慢性疾病的心脏衰竭中都检测到了升高的hscTn,包括:心肌炎、Takotsubo 心肌病、主动脉夹层、室上性心律失常、瓣膜病、肺动脉高压、中风和围手术期。有证据表明,cTn 还可能与射血分数减低的心力衰竭有相关性。与此同时,cTn 水平的串行监控可能成为心脏专科医生指导治疗干预心力衰竭的有效工具。发现,hscTnT 在AMI 和脑卒中组的全因死亡率的预测得分更加优秀。近年有研究指出AMI 发生可能性中低度的胸痛患者,血清hsTnT 诊断AMI 的性能优于cTnI。hscTn 可作为心房纤维性颤动的预后标志物,并作为高风险患者心源性猝死的筛查标志物。还可用于评估具有严重VHD (瓣膜性心脏病),主动脉瓣狭窄和二尖瓣返流的无症状患者的亚临床心肌损伤。
6.jpg 7.jpg
3.2 cTn 在肾病医学
Van等研究发现肾功能不全患者的TnT 水平有很强的昼夜节律性,而TnI 则没有。有些肾功能不全的透析患者即使没有心肌缺血也会有Tn 的升高。近期有研究指出如果透析患者的cTnI 检测值超过172%,cTnT 超过97%,才有理由怀疑AMI。
8.jpg

3.3 cTn 在急诊医学
由于公众危机意识增强,在患者有类似MI 的胸痛发作后就会尽早被送到急诊科。临床如何快速排除hscTn 升高是由于AMI 还是其他疾病尚缺乏统一规范,许多都不是由AMI 引起的,由于极低浓度的cTn 也能被检测出导致误诊了很多的AMI。在心电图检查心肌无缺血的情况下,hscTn的连续检测对AMI 有良好的阴性预测价值,心电图联合hscTn 检测进行AMI 风险评估可以用来帮助减少不必要的住院,从而减少对急诊绿色通道的占用,缓解医疗资源的紧张,减少医疗费用支出。近来有研究列举了运用hscTnI 排除早期AMI 的四种策略:第一种为hscTnI 检出限(limit of detection,LOD)< 2ng/ml ;第二种为LOD < 5ng/ml ;第三种为1h LOD <5ng/ml 并且1h内变化< 2ng/ml ;第四种为结合LOD < 2ng/ml 与1h 内变化<2ng/ml ;调查研究了2828 名在急诊科主诉为AMI 症状的患者,结果显示除了第二种不适合用于排除早期AMI 者,其他三种算法策略均表现良好,其中运用第一种算法排除AMI 的患者两年生存率为100%,其他算法为98.1%( P <0.01)。一般认为,一定时间内观察到cTn 升高或降低的变化是提高AMI 诊断特异性的关键之一,但是升高的幅度目前却缺乏共识,有专家将此幅度定为20%,有的定为30%,还有定为50%者,不一而同。
4、 非AMI的cTn 阳性

Tn响应释放于被损伤的心脏,因此是为AMI 的早期诊断所选择的生物标志物,用于改善患胸痛的结果。然而,在非心脏疾病中也经常遇到Tn 的值升高,所以Tn 的测试需要扩大到非预期的AMI 人群中。近来有研究发现,升高的cTnT 水平是社区获得性肺炎住院患者短期死亡的强大预测因子。有时候,也可能会由于血液中其他物质的干扰发生错误的结果。若增加的Tn 没有预测MI 的价值,可能有其他病因,包括血管炎,脓毒病,药物滥用,心肌炎,肺栓塞,败血症,运动神经元病变和肾功能衰竭。
cTn的测定已经变得越来越灵敏,已经能够在相当比例的不被怀疑为AMI 的稳定患者中检测到低浓度的cTn。虽然低浓度的cTn 通常被认为在正常的范围,但仍与其心血管事件的风险显著相关,据此cTn 已被添加到心血管事件风险的首选预测指标之列,然而对于个别患者的cTn升高的治疗意义仍不清楚。cTn 释放的根本原因也还有待进一步研究。cTn 水平与患者短期死亡率显著相关其中包括死于AMI 、肺栓塞或其他多学科不良事件。cTn 水平还与血流动力学稳定患者的突发死亡率相关。随着cTn 在多临床学科上的应用增加,发现cTn 的测定可识别心肌损伤,但不能识别心肌损伤的机制,随着研究的不断深入,需要在不同地区进行前瞻性调查研究来定义cTn 在不同学科患者身上升高的潜在作用及其指导治疗的预后收益。与此同时,迫切需要更多的辅助性指标并制定独立的标本采集指南和阳性预测值以减少漏诊和不必要的治疗。

IVD原料:纤维蛋白原Fg

人纤维蛋白原(Fgrinogen,Fg)是血浆中最早分离出来的一种蛋白质,由肝脏合成。是大分子的可溶性糖蛋白,分子量330 000~340 000,等电点5.5,沉降常数7.7~7.9。其分子为一个二聚体,呈长条状,长度50~60nm,含有三对多肽链(Aα2、Bβ2、γ2),由二硫键连接。三条多肽链分别由三条独立mRNA 转录,这三条基因相连成簇,均为不连续单一拷贝基因,它们共同位于第4 号染色体长臂q23~q32不到50kb 的核苷酸上。纤维蛋白原共含有19种氨基酸,其中天门冬氨酸和谷氨酸等酸性氨基酸含量较多,各占分子量的13.1%和14.5%。纤维蛋白原在溶液中带负电荷,一旦失去这些酸性基团,则有利于聚合。大量的文献表明,纤维蛋白原水平的变化不仅与凝血障碍、出血性疾病、弥漫性血管内凝血(DIC)、应激等有关,而且与冠心病(CHD)、心肌梗死(AMI)、脑血管病等有关,因而纤维蛋白原研究倍受关注。
9.jpg
Fg蛋白结构

纤维蛋白原是一种含2964个氨基酸的大分子糖蛋白,相对分子质量为340×103,首先在肝细胞中合成,由两个相同的组分(Aα,Ββ,γ)2组成六聚体,链间以二硫键相连。Aα,Ββ,γ三条多肽链借助AαCys28、γCys8和Cys9构成对称性二聚体。单体中AαCys36与另一单体ΒβCys65组成的二硫键对形成二聚体分子也起到关键作用。Aα、Ββ、γ三条多肽链相对分子质量分别为66 ×103、52 ×103 和46 ×103,并分别由610个、461个和411个氨基酸残基组成。三条链在肝脏由独立的多核糖体合成其前体蛋白(分别包括19、30、26个信号肽),在粗面内质网内将信号肽切除、疏水反应及二硫键形成等加工后,折叠、装配成成熟的二聚体分子,最后经糖基化、部分磷酸化分泌到胞外。
10.jpg
在成熟的纤维蛋白原二聚体分子中,中央区(E区)由6条多肽链的氨基端组成,形成二硫键结;两个外围区(D区)由Ββ和γ链的羧基端组成,而Aα链的羧基端折回参与E区结构。E区和D区之间由带状结构(coiled-coil)相连,coiled-coil区为Aα、Ββ、γ三链形成的α-螺旋结构,大约由110个氨基酸残基组成,coiled-coil区两端的二硫键对纤维蛋白原分子成熟二聚体结构的形成至关重要。coiled-coil区近氨基端部分的缺失对杂聚体和半分子的形成几乎没有影响,但会阻止半分子形成成熟的六链分子;相反此区远氨基端部分的缺失则会完全终止装配过程。用幼鼠肾细胞株(BHK)转染实验显示,纤维蛋白原的起始装配包括αγ和βγ杂聚体的形成,但不包括αβ杂聚体,第三条链的加入导致半分子αβγ的形成,而后二聚化形成成熟的六链的纤维蛋白原,参与血液循环。
纤维蛋白原分子中,有多个配体的结合位点,研究较多的是凝血酶作用位点和血小板糖蛋白IIb/IIIa的结合位点。凝血酶的裂解位点在Aα-16和Ββ-14作用后分别释放出纤维蛋白肽A和B,并同时分别形成纤维蛋白单体Ⅰ和Ⅱ。研究发现,Fg中有多个糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的结合序列,主要是α95~97、α572~574的RGD序列和γ400~411附近的10~15个氨基酸残基;并且两个多肽会相互抑制,说明两者在糖蛋白上的结合位点可能相同,也或是前者结合后导致糖蛋白构型的改变,而阻止另一种多肽的再次结合。其中γ400~411是血小板聚集的关键,α链的RGD 序列则不是必需的。由于Fg的3条多肽链是独立合成的,在成熟之前要经过加工和装配;每条多肽链的部分氨基酸的改变都可能影响这些过程,使3条多肽链不能装配成完整的Fg 分子。除了前述的二硫键的重要作用外,β 链的合成是装配的限速步骤,特别是Ββ73~93之间是装配所必需的;γ链的羧基末端氨基酸143~411,特别是γ387 也是关键。
11.jpg
FG在血管疾病中的意义

FG为重要的凝血因子,越来越多的研究表明高纤维蛋白原水平导致高凝状态,诱发血管疾病造成缺血性损伤。国外学者提出脑梗死发生之前降低FG水平,减少血栓形成的前体物质,阻断异常凝血过程,降低脑梗死的发生率。Knuiman等研究发现,FG 水平增高与脑梗死有密切的关系,并且FG的水平直接影响到卒中的严重程度,在12%的不可逆型、16%的进展型、85%的完全卒中型,FG 水平>4g/L。
12.jpg
FG在肿瘤疾病中的意义

血浆FG分解形成纤维蛋白,为癌细胞的生长、浸润和转移提供支架,FG亦可以作为不同的黏附分子的配体,增加PLT及肿瘤细胞间的黏附结合,促进肿瘤细胞的浸润和转移,PLT附着肿瘤细胞的表面,形成瘤栓阻碍免疫细胞攻击肿瘤细胞;鳞状细胞癌能刺激肝细胞产生大量的FG;恶性肿瘤与凝血功能的改变有密切的关系,肿瘤细胞通过组织因子或其他促凝因子激活FG,为肿瘤细胞转移提供有利的条件,因此FG对肿瘤细胞的生长、浸润、转移具有重要的价值。
FG在糖尿病中的意义

大量研究表明,糖尿病患者体内存在凝血、纤溶功能及血小板活性异常,呈血液高凝状态,患者血浆FG水平会明显升高。主要原因可能有:血液中纤溶活性的调节主要取决于内皮细胞分泌纤溶酶原激活物(t-PA)与纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的相对比例,血小板α颗粒中富含PAI-1,而且3/4储存于血小板中,抑制纤溶酶原激活剂的活性,使血浆中纤维蛋白浓度增高。此外,血浆中的一些脂蛋白与纤溶酶原激活剂竞争结合FG,从而抑制纤溶酶的活性,FG 水平增高。
FG在其他疾病中的意义

FG是肝脏合成的重要凝血因子,严重的肝脏疾病尤其是慢性乙肝患者,其肝功能严重受损,FG 合成量下降,因此FG的水平有助于准确判断肝病的病情、评估预后、指导治疗。当机体发生炎症时,血液处于高凝状态,部分凝血指标会明显升高,其中FG主要通过白细胞表面的受体与白细胞相互作用而参与炎症过程。因此在治疗过程中适当降低FG的水平对控制病情是有益的。
纤维蛋白原水平测定

血浆中纤维蛋白原生理含量为2.0~4.0g/L,该水平具有生理和病理双重作用。一方面保证在凝血最后一步,有足量的纤维蛋白原聚合成不可溶性纤维蛋白,另一方面又影响了血浆和血液粘滞度。纤维蛋白原水平受外伤、炎症、妊娠、肥胖、吸烟等影响,也受遗传因素影响。并随着年龄的增长呈进行性增高。

13.jpg

纤维蛋白原水平的测定也有助于缺血性心血管疾病的危险度判断。目前纤维蛋白原测定方法颇多,大体有三类,第一类功能测定法,即在血浆中加入凝血酶后测定所形成的纤维蛋白量或凝固时间。该类方法中Jocobsson 法为世界卫生组织(WHO)和美国国家临床检验标准委员会(NIBCC)推荐的参考方法,von Clauss 法为国外常规方法。该类方法测定的是有凝血功能的纤维蛋白原,因此最能直接反映血浆中具有凝血功能纤维蛋白原水平,所以特异性好;第二类物理化学法,主要通过盐析沉淀、热变性沉淀、电泳等测定纤维蛋白原,该类方法多数比较简单、快速,但是特异性不高,所测定纤维蛋白原不仅包括可凝固纤维蛋白原,而且含有异常纤维蛋白原(无凝固功能)和纤维蛋白降解产物和/或其它蛋白,其中有的方法精密度差,影响因素多;第三类免疫测定法,用抗纤维蛋白原多克隆抗体或单克隆抗体测定纤维蛋白原,该类方法大部分比较简单,缺点是因与纤维蛋白降解产物和异常纤维蛋白有共同抗原,而特异性不高。
纤维蛋白原亚组份测定

血浆纤维蛋白原亚组份测定自70年代已受到临床的重视。由于纤维蛋白原分子Aα链的异质性,血浆纤维蛋白原可被十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分为高分子组份纤维蛋白原(HMW、MW340 000)、低分子组份纤维蛋白原(LMW、MW300 000)和低分子′组份纤维蛋白原(LMW′、MW280 000)。一般认为,HMW 是纤维蛋白原的主要成分,而LMW 和LMW′是其降解产物,HMW 较LMW 和LMW′易凝固、易聚合和不易溶解于水。这种差异的生理意义在于外伤、应激时HMW 的增加,有利于机体保护。但病理状态时,如DIC等早期,当纤维蛋白原总量尚未改变,HMW/LMW 可能已有变化,可提示血液有高凝倾向;而AMI 早期是因为HMW 合成增加使纤维蛋白原明显升高,所以HMW 增高可作为早期诊断AMI 的指标;但CHD 中则是以LMW 增高为主,因此LMW 在CHD 发病中起关键性作用;另外在某些血栓病中存在有HMW明显高于LMW 现象。通过123 例1~93岁健康人纤维蛋白原亚组份分析可知,人群中有随年龄增加血浆HMW 水平逐渐下降,而LMW 水平逐渐升高的倾向。这与CHD 发病率随年龄增高而升高趋势有一致性,表明纤维蛋白原亚组份的改变可能与CHD 的发生、发展有一定的病理联系,因此纤维蛋白原亚组份的测定具有重要的临床意义。
纤维蛋白原亚组份测定方法有两类,一类SDS-PAGE 法,其中Mills D 方法可直接用血浆进行电泳;Holm 方法需将血浆中纤维蛋白原形成纤维蛋白凝块,再用尿素溶解凝块后进行电泳。前者由于血浆中其它蛋白干扰,结果不稳定,后者可排除其它蛋白干扰,能反映有凝血功能的纤维蛋白原,并且电泳所得条带清晰,容易分辨,结果稳定,不仅能反映血浆中纤维蛋白原三个组份的比例,同时还能观察到五条弱亚组份。该类方法的参考值:HMW69.7 ±5.1 %,LMW26.5 ±4.8 %,LMW′3.8 ±1.8 %。第二类是利用不同的离子强度的甘氨酸溶液将总纤维蛋白原和HMW 分别沉淀,然后计算LMW。常用的是Sasaki 法,该类方法受到纤维蛋白降解产物或其它蛋白的影响,特异性较差。
纤维蛋白单体聚合功能测定

纤维蛋白原被凝血酶作用形成纤维蛋白单体,继而发生聚合反应形成凝块。观察纤维蛋白单体聚合速率(FMPV)不仅能了解纤维蛋白原分子对凝血酶的反应性,且异常时有临床价值。FMPV 降低可能与纤维蛋白原结构异常有关。测定时可用凝血酶、爬虫酶或蕲蛇毒使纤维蛋白原转变成纤维蛋白单体。用凝血酶更符合生理状况,但需要在纯体系内进行,而用爬虫酶或蕲蛇毒可避免血浆蛋白抑制酶、肝素和纤维蛋白原或纤维蛋白降解产物的影响,并可直接用0.515 ±0.154,A最大:0.136 ±0.030,FMPV/A最大:3.579±0.256。
纤维蛋白原作为急性时相蛋白和缺血性心脑血管病的危险因素的理论已被普遍接受,纤维蛋白原水平、亚组份、功能、基因多态性的研究和应用不仅为出、凝血性疾病, 而且为心脑血管疾病的防治提供一定的理论依据。

回复

使用道具 举报

相关 / 推荐

说点什么

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册
HOT • 推荐