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FISH是鱼?不,是荧光原位杂交

caclp 2019-12-10 09:14:01 显示全部楼层 阅读模式 打印 上一主题 下一主题
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FISH是啥?
FISH,荧光原位杂交。目前广泛应用于:
(一)基因(或DNA片段)染色体定位和基因图谱绘制
(二)发现染色体数目与结构异常,广泛应用于快速产前诊断
(三)血液肿瘤学
(四)实体肿瘤学

技术原理是根据核酸碱基互补配对原则,同源的DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA两条核酸单链,在一定条件下结合成双链。荧光素直接标记的核酸探针及待测DNA,经变性后双链打开,两者混合杂交,互补形成杂交体,最后通过荧光显微镜进行观察,从而实现对目标核酸的定性、定量和相对定位分析。

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图1:FISH的实验流程示意图

在体外诊断中,H&E染色可以显现细胞的基本结构,免疫组化(IHC)可以揭露某个特定分子在组织中的分布,而FISH,则可以更进一步揭示更为微观的变化,如病原体、染色体异常等。


FISH探针的标记与探针
FISH探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸共价结合,而间接标记是用生物素标记再通过荧光素亲和素来进行检测。这两者的核心区别则是直接标记法无法将荧光信号放大,因而其灵敏度不如间接标记法且无法检测长片段。

FISH探针种类也分为DNA探针与RNA探针。DNA探针制作最常用的方法有两种,切口平移法与随机引物法。图2示例便是典型的切口平移法(Nick Translation),利用微量的DNA酶Ⅰ使待标记的双链DNA分子产生若干切口,先从5‘-末端切除旧链再顺势将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上。

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图2:切口平移法制备DNA探针原理示意图

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图3:随机引物法制备DNA探针原理示意图

第二种DNA探针制作方法则是随机引物法(图3)。这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外,还在许多方面优于缺口平移法,比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50%以上,因此使用少量DNA也可以进行有效标记。相比于切口平移法,随机引物法可以用于更小的DNA片段。

RNA探针制备最常用的则是体外转录法。进行体外转录时,先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中,然后在RNA聚合酶的作用下,以DNA为模板,以含有标记的三磷酸苷为原料,对启动子下游的序列进行转录,而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子,如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体T3、T7。

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图4:在核苷三磷酸和相应RNA聚合酶存在条件下,
体外转录为RNA

在整个过程中,除却聚合酶浓度、核酸纯化程度是反应的关键因素外,所使用的荧光素质量也会影响最终的结果呈现。


荧光素—Sigma-Aldrich Atto染料系列
Sigma-Aldrich(现默克生命科学下属的子品牌,以下简称sigma)的Atto染料系列,化学结构稳定、荧光效率高、易和核酸或者抗体分子结合,并且可实现出色荧光成像效果。

相比于荧光基团,Atto染料具有更强大的优势:
信号寿命长,长时间曝光下更耐光
Atto染料显现出比羰花青染料或大部分细胞和生物分子固有的自发荧光更长的荧光信号寿命 (0.6-3.8 ns)。

激发波长更长背景降噪
可降低样品、溶剂、玻璃或聚合物支架的自发荧光。

Atto染料对寿命较短的荧光基团的干扰较小,提高了生物分析和成像技术的整体灵敏度。

可用于荧光多重检测
tto染料可将探针和生物分子缀合进行多重检测。选择发射信号分开的两种Atto染料可支持单个实验的多个激发和测量结果。

另外,针对探针制备,Sigma还提供经由Atto 488标记的dUTP,其特殊的分子结构可以有效避免探针制备时产生的二聚体从而弱化杂交结果。


了解更多 dUTP产品
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以下是Atto染料系列可替代的荧光基团:
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