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微生物检验 | 金黄色葡萄球菌临床检测方法全在这里

caclp 2019-11-25 10:13:54 显示全部楼层 阅读模式 打印 上一主题 下一主题
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) 是葡萄球菌属,在多种感染性疾病中占主要地位,是临床上威胁人类健康的常见重要病原菌之一。所以,准确有效地从临床标本中检测此菌在疾病的治疗上有突出意义。

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一、常规检测

常规检测金黄色葡萄球菌主要通过对临床标本进行分离培养纯化的方法,将可疑菌株进行形态学、染色以及生化检测,最终鉴定金黄色葡萄球菌。虽然传统检测方法需要时间较长,对检验人员素质要求较高,却是临床最为常规、应用最为广泛的方法。

1、直接涂片染色法
取患者的脓汁、痰、穿刺液等标本适量,涂于载玻片上,通过革兰氏染色,显微镜镜下检查,如果显微镜视野里发现革兰氏阳性或者形似葡萄串状随机排列的球菌,即可得出初步结论。该方法操作简便,不仅可以观察细菌的形态染色特点,更重要的是可以为后续选择合适的鉴定程序提供参考。在临床上除少数标本(如血、便)外,绝大多数标本在分裂前均需进行染色镜检。

2、细菌培养与鉴定
根据细菌的生长特性,人工制造细菌的生长环境对细菌数量进行扩增,再通过细菌的生物化学特性利用其反应现象对细菌的种类进行判断。

(1)分离培养:挑取适量标本三区划线接种于血平板或高盐甘露醇选择培养基上,培养18-24h后,挑取圆形凸起、光滑,呈金黄色或淡黄色,可产生溶血的可疑菌落进行涂片、染色、镜下观察。

(2)鉴定:金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌,镜下观察菌群形状似葡萄串,具有耐盐的性质和将甘露醇分解的特性,接种于高盐甘露醇琼脂培养基上,菌落表现为淡黄色,挑取纯培养的菌落,通过生化反应对细菌进行鉴定。金黄色葡萄球菌触酶阳性,氧化酶阴性,耐热核酸酶试验阳性,呈阳性结果的还有血浆凝固酶试验。在金黄色葡萄球菌的检测中耐热核酸酶试验和血浆凝固酶试验同样是检测金黄色葡萄球菌是否具有致病性的常用试验。
二、快速检测法

1、免疫学方法
免疫学方法就是利用具有高度特异性的抗原与抗体反应从而进行菌种检测的方法,具有较高的灵敏度,避免了反应中其他物质对反应的干预,把检测步骤进行了有效的简化。

(1)乳胶凝集法:金黄色葡萄球菌鉴定试剂盒,将特定蛋白涂布在微粒上以制备成致敏微球,当特异的致敏微球与该菌融合,此细菌与致敏微球表面的特异性蛋白凝集,由此乳胶颗粒快速凝集成肉眼可见的蓝色颗粒状混合物,最后达到鉴别金黄色葡萄球菌的目的。

(2)酶联免疫吸附法:通过将酶标记为抗体(抗原)进行酶联免疫吸附测定,方便测试对象中对应的抗原(抗体)与酶标记抗体(抗原)产生极强的反应。在遇到对应的酶底物时,酶以其高效性、专一催化性,快速地与底物反应,从而产生有颜色的反应产物。以反应产物颜色的深浅,来分析待检物里有无特异的抗原(抗体)和含量的多少。该方法可以对测试样品进行定性分析或定量分析,具有准确、高效、迅速、方便等优点,所以这种方法普遍用于生物医学和临床医学。检测方法可分为双抗体夹心法、竞争抑制法、间接法等。所以,用于通过酶联免疫吸附法检测肠毒素的试剂盒在临床中大量使用。

(3)化学发光酶联免疫检测法:这种方法是利用化学反应发出能量进行试验反应,优点是试验操作简单、试验成本低,广泛用于理化分析。对比于荧光法,化学发光法不再需要外部光源提供能量,所以降低了光散射,增强了检测敏感性。缺点是单一性较差,会对大多数的化合物做出反应,却不是针对单一化合物。
2、分子生物学方法
PCR方法利用DNA高温下变成单链的过程,低温下,根据碱基互补原则,在DNA聚合酶的作用下产生新的DNA。1983年由美国人Mullis首先提出假设,1985年发明了PCR,即为简易DNA扩增法。

(1)多重PCR技术:该试剂盒用于从金黄色葡萄球菌中分离DNA,并通过仪器测量DNA的浓度。再利用GenBank等生物信息数据库设计sea、seb、sec、sed四种PCR引物。利用扩增程序将出现条带的产物进行测序,建立多重PCR快速检测体系,经过调整退火温度,模板浓度等优化反应过程,并记录下检测结果。该方法重复性较好,特异性较高,可用于食物中毒和风险检测,为临床快速判断菌类感染,精确诊断确立了新方法。

(2)实时荧光定量PCR:这种方式把金黄色葡萄球菌的在线实时测定变成现实,与经典的PCR方法进行检测进行比较后发现,此方式具有更好的准确度和高灵敏性。首先设计制备探针,再进行待测核酸样品的制备,杂交反应开始,PCR反应程序信号处理,显示结果,结果分析。

(3)环介导等温扩增技术:LAMP法是近年来刚刚发展并逐步成熟的全新检测方式,与经典PCR对比,该方法没有将DNA模板加热变形等过程。LAMP在灵敏性、准确度上完全超过经典PCR,不再需要特殊的仪器即可对金黄色葡萄球菌进行实时检测,成本远低于荧光定量PCR。

(4)基因芯片技术检测:该技术又称DNA芯片,该方式检测原理是通过已知核酸探针的序列,在基片表面加入已知序列的靶核苷酸探针,当待测核酸与探针序列结合时,利用荧光发现最亮的荧光位置,并且可以获得完全互补的序列。该技术先进,有着无法超过的优越性。
三、其他快速检测方法

1、显色培养基
该培养基是由微生物的自身反应,从而得到的酶与有色的底物反应以测定微生物种类。该底物由产色基因和微生物代谢物构成。其反应在酶的催化下,基因游离在反应体系中与酶结合并显示出颜色,观察菌种的颜色即可进行细菌种类的分辨。显色培养基远强于传统鉴别培养基的敏感度。金黄色葡萄球菌菌落是一个绿色菌落,在菌落周围有黄色。

2、快速测试片
测试片是以纸、膜等作为载体,用特定的着色剂吸附在培养基上,一种判断微生物生长状态,反应程度的快速方法。该快速测试片具有特异性强,灵敏度强,快速,经济等特点。尤其是在临床实际中对于有食物中毒反应的患者的治疗上有极高的价值。

3、生物传感器技术
该方法是利用生物的物理、化学性质、声信号、光信号等,转换为可以被生物传感器识别的电信号,用计算机将生物信号放大,从而检测生物分子。

4、计算机视觉技术
利用人工智能、生物学、图像分析等方法,利用计算机扫描图像的相关软件进行数据分析,利用显微图像对细菌进行分类识别,该方法先进,准确,成本低,灵敏度高。
四、总结

常规培养鉴定法因其成本较低,上手容易,是目前临床最为常用的传统方法。然而,这种方法消耗时间长,已经不能适应当代临床实验室快速检测的需要。随着医学检验技术的不断发展,在快速检测方法中金黄色葡萄球菌的检测也得到了飞速发展。免疫学方法使用将抗原和抗体相结合的方式,特异性强,但存在假阳性或假阴性现象。PCR的方式检验结果准确,从分子水平定性,可以将实验时间缩短50%以上,明显节约了人力物力,但容易出现外源DNA的污染。PCR技术将检测方法带入分子水平,提高了检测的精准性,但需要人员培训和设备引入,成本相对较高。LAMP易于操作,降低了成本,提高了金黄色葡萄球菌的检出的灵敏性,具有良好的前景。总之,该细菌在未来临床检验的发展趋势是准确,方便和快速。以常规检测方法为基础,结合快速检测方法对细菌进行有效检测,特别是分子生物学方法,在基因的角度,提供了新的检测手段,极大推动了对该细菌检测的发展,现如今计算机视觉技术以及生物传感器检测也逐步走向成熟。

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