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干货 | 一文读懂体外诊断中的核酸提取方法

caclp 2019-11-11 09:15:12 显示全部楼层 阅读模式 打印 上一主题 下一主题
前言
体外诊断,即IVD(In Vitro Diagnosis),是指在人体之外,通过对人体样本(血液、液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息,进而判断疾病或机体功能的产品和服务。
而检测人体样本的关键步骤之一,即是样本中的核酸(DNA和RNA)纯化核酸纯化的方法是影响所提取核酸质量的重要因素,只有高质量的核酸才能满足下游的各种应用。
目前,常见且适用于所有样品类型的核酸纯化方法有四种

1
速率区带离心法

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在此法中,密度梯度液顶部的狭窄样品区带被分层,从而避免不同沉降速率的颗粒之间交叉污染问题,(见图1)。然而,由于上样区带狭窄,因此限制了可容纳在密度梯度液之上的样品量(通常为10%)。
图1. 样品在密度梯度液之上形成一层狭窄区带(B)。在离心力作用下,颗粒根据其质量大小以不同的速率移动(C)。
梯度液可以稳定区带,并且可以增加密度和粘度。当区带中的颗粒向下移动通过密度介质时,移动速度较快的颗粒就会先于移动较慢的颗粒,从而形成含有类似大小颗粒的各个区带

此法的缺点是:
①  离心时间较长;
②  需要制备惰性梯度介质溶液;
③  操作严格,不易掌握。
2
苯酚- 氯仿萃取

苯酚和氯仿均为有机溶剂,其萃取核酸原理是苯酚与氯仿对于与核酸结合的蛋白质有极强的变性作用,但对核酸本身没有影响。经离心后,形成上层水相下层酚/氯仿相,变性后的蛋白质溶于酚/氯仿相或者在两相交界处形成凝胶层,而核酸易溶于水而不溶于有机溶剂从而留在水相;同时,氯仿可以有助于有机相与水相的分离和去除溶于水的部分酚。最后,再将核算通过乙醇沉淀即可达到提取的目的。
此法的缺点是:
① 蛋白质难以彻底去除;
② 操作难度大且费时;
③ 使用危险化学品。
3
离心柱纯化

此种方法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜,在高盐环境下,这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可被吸附在离心柱上,而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离。最后通过洗脱,将核酸从吸附膜上脱离,即可得到纯化后的核酸。离心柱纯化也是的试剂盒提取中广泛的使用方法。
但即便如此,离心柱纯化法仍存在缺点:
① 高度依赖吸附膜的结合能力;
② 洗脱不完全导致核酸流失;
③ 无法大量提取核酸。
流程图

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图2. 离心柱纯化法示意图

4
磁分离法

携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸,主要用于从人血清或血浆样品中提取DNA 和RNA(例如从血液样本中检测HIV 或HBV 病毒基因组的样品制备)。一般而言,将样品与结合缓冲液和磁珠混合,核酸与磁珠结合后,经过数次洗涤与磁场捕获,洗脱下来的核酸即可通过PCR 或其它特定方法来检测特定的DNA 或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业,且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。

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图3. 磁珠核酸提取流程示意图

相较于实验研究中单一且可控的环境,实际应用上在核酸提取上除了技术壁垒之外还会面临样品量有限、样品遭到污染等挑战。因此,各大公司正致力于开发更加全面的解决方案,以提高核酸纯化的通量。


纯化好帮手——MagPrep® Silica 磁颗粒

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图4. 电镜照片下MagPrep® 硅粒子的粒径和晶体结构

Sigma-Aldrich®(现默克生命科学下属的子品牌,以下简称sigma)MagPrep® Silica 磁颗粒(如图4 所示)正为满足这一需求而开发,MagPrep® Silica 磁颗粒是由表面包裹着一层硅的磁铁矿组成,而非市面上常见的磁性微球。这些悬浮在缓冲液(50mM MES, pH 5.5)中的黑色颗粒平均粒径为100nm( 通常为50–200nm)。小粒径的磁颗粒拥有更大的表面积,这对能否从大量样本中成功提取微量的目的分子至关重要。此外,粒径小的磁颗粒可保持几分钟的悬浮状态,这也为目的分子的结合提供了充裕的时间。由于磁含量高达95%,磁颗粒很容易在磁场中迅速分离。通常情况下, 磁场捕获反应在2 分钟内即可完成。磁分离技术让各大实验室能够在一天时间内实现成千上万的核酸样本自动化纯化。此外,该技术在检测诸如细胞粗提取物或类似食品粗匀浆物等复杂样品时也极具优势。

除却核酸,MagPrep® Silica还可以

• 吸附细菌
• 吸附病毒
• 吸附白细胞
• 分离血液中的全DNA
• 分离细菌中的全DNA
• 分离病毒DNA/RNA
• 纯化PCR 片段
• 去除测序反应中的染料
• 分离质粒DNA

并且MagPrep® Silica可从多种样本中提取目的物质,如:

• 能从全血中吸附白细胞
• 能从生长基质中吸附细菌
• 能从血浆中吸附病毒
• 能在高离液和酸性条件下吸附核酸
• 可使用水性或含乙醇的缓冲液洗涤

MagPrep® Silica 磁颗粒产品类型
我们可提供3 种MagPrep® Silica 磁颗粒:“LS”(基础型),“MS”型和“HS”型。“LS”型吸附RNA 效果好,在特定条件下,也能吸附DNA。“HS”型选择性吸附DNA。“MS”型可同时吸附DNA 和RNA。用户可根据核酸纯化过程中的结合、洗涤条件以及样本类型的不同选择最佳搭配。

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*可根据客户要求提供更大的包装规格

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