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技术速递 | 详解用于体外诊断试剂盒检测的PCR扩增技术

caclp 2019-10-25 15:36:34 显示全部楼层 阅读模式 打印 上一主题 下一主题
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聚合酶链反应(PCR)用于生物科学研究的所有领域, PCR技术的广泛采用彻底改变了生命科学研究。PCR已成为分子生物学应用最普遍的技术之一,基础技术已经有了许多改进,并发展出许多变型,以适应具体应用,包括逆转录PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qPCR)、逆转录qPCR(RT-qPCR)和数字PCR(dPCR)。PCR是一种强大的技术,但与此同时,它简单易用,成本较低,因此其应用普遍而多样,包括临床、法医和诊断领域。


PCR扩增技术

今天,我们将要介绍三种在常规PCR基础上改进并同样应用于体外诊断试剂盒检测的PCR扩增技术。
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首先,我们先复习一下典型的PCR程序,任何种类的PCR都万变不离其宗基于这个原理:

初始变性:将反应温度升至95°C,孵育反应物2-5分钟(根据酶特性和模板复杂性,最多10分钟),以确保所有复杂的双链DNA(dsDNA)分子被分割成单链以便扩增。

循环(图1):
1. 变性:将反应温度升高至95℃,其将所有dsDNA解链(破坏互补碱基之间的氢键)成单链DNA(ssDNA)。
2. 退火:将温度降低至低于引物的解链温度(Tm)约5℃(通常为45-60℃),以促进引物与模板的结合。
3. 延伸:温度升至72℃,这是DNA聚合酶活性的最佳温度,在这个温度杂交的引物被延伸。

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图1:PCR中典型循环反应过程的示意图

重复:步骤1-3循环进行,使扩增子以指数扩增

多重PCR

相比于传统PCR只使用一对引物,多重PCR则是在同一反应体系内加入两对及以上引物,因此也被称为多重引物PCR。其主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定,如呼吸道病毒、肺炎链球菌的鉴定,脊髓性肌萎缩症的检测等。

巢式PCR

巢式PCR使用两对引物,第一对引物扩增与常规PCR无异,而第二对引物则是结合第一次PCR的产物,在其内部再进行第二次扩增,故称为巢式引物。而且,第二次PCR获得的片段长度大大短于第一次产物。巢式设计可以提高扩增的特异性,因为当第一次PCR时产生的非特异性片段将不会与巢式引物结合从而有最终片段的产生。巢式PCR一般应用于动物方面,如:梅毒螺旋体,HIV,肿瘤基因等。

ARMS-PCR

扩增组织突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR),又称为等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR),这是一个非常有用的方法来鉴定点突变或基因多态性。ARMS-PCR仍然使用一对引物,但其中一个引物的3’端与目的突变基因配对。如此,3’端与正常DNA模板的失配可显著减少扩增,从而做到选择性扩增突变DNA模版。因为突变设计在3’端引物序列中,若出现错配则不会出现扩增,如此引物仅仅识别突变序列,而不识别正常序列,从而达到检测只知突变基因型的目的。需要注意的是,具有高保真度DNA聚合酶不能用于此种PCR, 因为在此聚合酶作用下,即使引物失配仍然可以产生扩增。临床上,很多肿瘤基因突变检测就是使用ARMS-PCR法来鉴定。
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图2:对于β地中海贫血IVS1-5突变类型,在β珠蛋白中,ARM-PCR引物对正常和点突变等位基因的检验。A段显示与DNA模板中突变(C)匹配的ARMS引物, B段显示突变ARMS引物与正常序列(G)之间的不匹配,C段显示了正常序列(G)以及与之匹配的引物,D段显示正常正常引物和突变(C)之间的不匹配。蓝框显示在引物的最后五个核苷酸中的一个额外失配以进一步增加它的特异性。

无论选择什么样的PCR技术或应用,理论上,40轮扩增后会产生240或1012个相同的扩增子。虽然理论PCR应产生连续指数扩增,然而反应最终会因为非特异性扩增达到平台期。非特异性扩增一般是因为在室温下进行PCR反应时,引物与非特异性模板产生了结合,或者形成引物二聚体。为避免此种情况发生,一种办法则是在反应中使用热启动Taq DNA聚合酶。

热启动Taq DNA聚合酶

Sigma-Aldrich(现默克生命科学旗下的子品牌,以下简称sigma)JumpStartTM Taq DNA聚合酶是一种抗体失活的热启动酶,设计用于最大限度降低非特异性扩增并同时提高靶标的产量。一旦反应温度达到 70°C,Taq DNA聚合酶活性就会得到恢复,使得PCR具有更高的特异性和产量。这种抗体-酶复合物可实现简单便捷的设置,并相对于手动热启动技术具有更低的污染风险。该酶还可以被加入到预混液制备中,从而实现反应之间更高的一致性。与化学变性的热启动不同,普通Taq DNA酶激活可能需要10分钟,抗体介导的热启动酶则可在60秒内被激活。

此外,Sigma另有JumpStartTM REDTaq®,是高品质 Taq DNA聚合酶与惰性红色染料的独特混合物。该染料能够快速目视确认酶的添加和反应混合。另外,REDTaq反应混合物的PCR产物还可用于自动测序,手册测序和限制性酶切,既不会引起荧光伪影,也不会阻碍测序反应或读取长度或对其他下游应用产生影响。如果需要去除染料,可以使用任何标准纯化方法轻松完成。

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表1:我们提供不同特性的热启动DNA聚合酶,
以满足不同需求。

除却JumpStartTM热启动DNA聚合酶之外,我们还提供FastStartTM Taq,KOD XtremeTM和KOD系列的DNA聚合酶,可根据不同特性选择与实际需求选择最为匹配的DNA聚合酶(图3)。

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图3:四大DNA聚合酶系列特性总结与比较

同样,针对不同特性的mRNA模板,我们还提供不同种类的逆转录酶,如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶、eAMVTM逆转录酶和ThermaStopTM逆转录酶。具体应用场景见图4。



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