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PCR传奇史:一个生物技术的故事(两个版本)

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趣味版
想当年曾听施一公教授吐槽自家博后:“他刚进我实验室的时候,连PCR都不会!”确实,对每个生物狗来说,PCR是基本技能,因为生物实验中用到PCR的地方实在太TM多了!

PCR的全称是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简单说就是用人工技术不断复制DNA,让它一变二,二变四,越变越多。自然状态下提取的DNA样本浓度一般都比较低,通常要通过PCR扩增后,才能用于检测、测序、转基因等操作。

PCR实验大家都没少做,但要说到PCR技术的发明过程,知道的人可能不多。而PCR技术发明者的灵感来源,说起来更是让人大跌眼镜。

“浪”出来的PCR技术

1983年,Cetus生物公司的职员凯利·穆利斯和女同事约会的时候磕了些迷幻剂,嗑药后驾车在高速公路飞驰时(危险动作切勿模仿),路边的两排路灯在他眼前幻化作DNA双链,在他眼前不断离合、延伸……穆利斯意识到,他发现了扩增DNA的方法!

穆利斯觉得自己能搞个大新闻,兴冲冲地向公司汇报了自己的想法,领导们都震惊了:“TMD在公司乱搞男女关系、嗑药,还有脸拿出来说?!”

领导们一致决定,先给他降职转岗,如果他不能把他吹嘘的PCR技术发明出来,再让他收拾包裹滚蛋。顺便说一句,穆利斯之前的两份工作分别是自由作家和蛋糕店店员(店老板是他前妻),如果这份工作也丢掉,他真的要吃土了。

在这种情况下,穆利斯还不忘跟公司讨价还价:“我生物底子太烂,能不能派几个技术员来帮我?”

公司领导:“少来了,你不是生物化学博士,还发过Nature吗?”

穆利斯:“可我那篇Nature是关于宇宙学的!”

情景还原:穆利斯在加州大学伯克利分校读博时,过着白天实验室(合成迷幻剂),晚上宿舍(嗑药)两点一线的生活。一次他嗑药磕嗨,在幻觉中看到了宇宙大爆炸,他醒来后把那个解释大爆炸宇宙学的理论草草写下来投给Nature,竟然真发表了。学校见他发了Nature,便给了他一个博士学位(博士迟迟不能毕业的生物狗切勿模仿,否则后果自负)。

公司领导一听,好家伙,嗑药都能发Nature,难道他这次嗑药出现的幻觉也大有价值?于是一下子给他派了三个技术员,帮他研发PCR技术。1984年11月,这些技术员们完成了第一次PCR实验,对一个49 bp 的DNA片段进行了10个PCR循环的复制扩增。

“酶”女相助

生物狗都知道,PCR循环主要分三步:变性,退火,延伸。先用高温让DNA双螺旋结构变性,使两条互补链分开变成单链;然后降低温度,让引物与单链DNA结合;最后, DNA聚合酶跟在引物后面,给单链DNA合成另一条互补的链,DNA的复制就完成了。

穆利斯的PCR技术最初用的DNA聚合酶是使用大肠杆菌DNA聚合酶,但这种酶不耐高温,一高温就失活了。所以,技术员要在每一个PCR循环的退火阶段及时加入聚合酶,让它进行DNA复制,然后到了下一个循环,这些聚合酶在高温变性阶段全部失活,只能在高温后加入新的聚合酶。这样不但麻烦(否则穆利斯也不会需要这么多人手),而且成本非常高(生物狗都知道酶有多贵)。

穆利斯也觉得这样不行,提出要换一种耐高温的DNA聚合酶,在高温状态也不会失活,这样整个PCR过程只需要加一次酶就够了。

那有没有这样的耐高温酶呢?还真有!美国的黄石国家公园有个大棱镜温泉(又叫大虹彩温泉),它是美国最大、世界第三大的温泉,水温高达85℃。这个温泉的特异之处是,水面从里向外呈现出蓝、绿、黄、橙、橘、红等各种颜色,像棱镜折射出来的太阳光一样五彩缤纷。

热气腾腾的大棱镜温泉

这些像玛丽苏头发一样的彩虹色,其实是嗜热菌的颜色。这个温泉里生活着大量的嗜热菌,它们在85℃以上的高温也能生存,而且体内含有各种色素,使温泉呈现出各种颜色。

1973年,台湾女生钱嘉韵赴美留学,她在辛辛那提大学生物系读研期间,从大棱镜温泉的嗜热菌中提取了耐高温的DNA聚合酶。但当时PCR技术尚未发明,所以这种耐高温DNA聚合酶也没有用武之地。钱嘉韵的这个研究,只发了篇研究论文便宣告结束。

但这篇论文却成了穆利斯的灵感之光。1986年,他按照钱嘉韵论文描述的方法,只花了三个星期就成功提纯了耐高温DNA聚合酶,把它用于PCR,效果好得惊人。这种聚合酶不但大大简化了PCR工作,同时专一性及活性都比之前使用的酶更强。

Cetus公司高兴地把穆利斯推荐给诺奖得主詹姆斯·沃森(DNA双螺旋结构发现者之一),沃森一见穆利斯,顿感惊才艳绝,邀请他参加冷泉港实验室的“人类分子生物学”会议,报告PCR的原理及实际应用结果。这是穆里斯生平第一次受邀演讲,而且参会的都是学术界的大牛。

“机”友加盟

现在的PCR操作非常简单,往管子里加样完毕,扔PCR仪里跑上几十个循环,就可以拿出来愉快地跑胶验证了。在PCR仪跑循环的一两个小时里,勤快的生物狗可以做点其他实验,偷懒的就会摸鱼看个电影玩个游戏什么的。

但穆利斯当时还没有PCR仪,所以当时他做实验的画风是这样的:分别将三个水浴温度恒定在三个温度:高温变性温度、退火温度、延伸温度,然后把一个装着PCR管的小篮子,放进高温变性水浴槽里泡着,十几秒钟后估计变性得差不多了,然后把篮子放退火水浴槽里泡几秒钟,再放延伸水浴槽里几十秒。反应一个循环,就要把篮子在三个水浴锅依次泡过。几十个循环下来,技术员的手都抖得跟帕金森一样。

为了减少这些生物民工的劳动量,Cetus公司在1988年发明了第一台PCR自动化热循环仪 ,PCR技术实现了自动化,同时一票PCR技术员也随之失业……

有了耐高温DNA聚合酶和PCR仪这两大法宝,PCR技术得到了很好的运用。1989年,Science杂志隆重报道了PCR技术和耐高温DNA聚合酶,Cetus公司也和罗氏公司合作,将PCR技术用于临床诊断。1991年,罗氏药厂以三亿美元买下了Cetus公司的PCR技术专利。那可是九十年代初的三亿美元!

然而,这笔巨款没有穆利斯的份儿,因为在1985年PCR技术初见成果的时候,Cetus公司催穆利斯赶紧把这技术写论文投稿,但穆利斯沉迷电脑游戏迟迟懒得动笔,公司为了赶时间,让技术员先写了篇论文投Science,等重度拖延症患者穆利斯终于写好论文想投稿时,关于PCR的论文已经不新鲜了。穆利斯表示被公司其他人抢了功劳很不爽,参加完沃森的“人类分子生物学”会议后不久就辞职离开。

穆利斯辞职时,只拿了一万美元和五个月薪水,日后PCR技术的巨额利润,都没他什么事了。他后来辗转在几家生物公司工作,靠着“PCR发明者”的名头,也能混碗饭吃。

他就这样一直浪着,还迷上了冲浪,在1993年的一个清晨,他冲浪回来被一群记者包围,他才知道,他凭PCR技术获得了诺贝尔奖!

穆利斯一下子C位出道,名利双收,变得更浪了,他嗨皮地娶了第四任老婆,还写了一本名叫《心灵裸舞》的自传,一听就知道不是什么正经书……

虽然PCR发明故事如此狗血,但这项技术确实极大地推动了生物学的进步。所以说,只要你能做出诺奖级的成果,你也可以随便浪(但是不能嗑药)!

正说版
现在让我们回到1953年,双螺旋发现的那一年。那年Kary Mullis 8岁,正是和小伙伴们漫山遍野瞎跑的年纪。在他出生的1944年,薛定谔出版了《生命是什么》。当然了,8岁的他既看不懂这部生物学著作,也完全理解不了DNA结构的发现到底意味着什么。事实上很长一段时间里,他都对生物学毫无兴趣。

Kary Mullis
比起生物,Mullis反倒在化学领域上显得颇有天赋。十几岁的时候,他就从家里偷来糖,混上药店里买来的硝酸钾,和小伙伴们自制火箭;在乔治亚理工学院修习化学学位期间,他也常常自己合成有毒物质和爆炸物。很幸运,几乎没人管他,那段时光让Mullis掌握了不少有机化学知识。

所以到底为什么他选择了生物化学作为接下来的研究方向呢?Mullis自述只对小分子感兴趣,而PCR出现之前的DNA又长又“稳如泰山”,和他喜欢的化学合成完全搭不上边。修完硕士修博士,在加州大学伯克利分校读了六年生物化学,到1972年毕业,Mullis依旧是只懂化学,不懂生物。

好在他的导师Joe Neilands很宽容,他并不限制学生选课程,所以Mullis赫然选修了一门天体物理学。神奇的是这门课他可能学得不错,甚至在1968年时发表了一篇名为《十年逆转的宇宙学意义》的论文,发在《自然》上。多亏了这篇论文,要不然他恐怕拿不到博士学位。

Mullis此时应该没想到自己日后的成就
毕业后,Mullis没有想好要做什么,于是就先随着妻子来到堪萨斯州。起初他想当个作家(执念很深,后来确实出书了),但是遗憾的是毫无天赋。随后他在医院工作了一段时间,又因为离婚回了伯克利,做了两年餐馆的经理人。

这里要提到一位好朋友Tomas White,是这位朋友劝说他回到学校继续深造,也是White介绍他到Cetus工作,后来又在Mullis难以立足的时候拉了他一把。

Mullis来到加州大学旧金山分校,进行药物化学的博士后研究。学习期间,他了解到,DNA也可以通过化学方法来合成。Mullis对此产生了兴趣。1979年,他来到Cetus的时候,也是负责合成寡核苷酸,给公司其他部门的同事使用。

Mullis确实在化学合成上有天赋,他很快搞出了计算机自动合成程序,工作流程大大简化。1981年,他就当上了实验室的负责人。

128号公路

1983年春天的一个夜晚,Mullis载着当时同在Cetus工作的女友从旧金山前往乡下度过周末。汽车行驶在蜿蜒盘旋的128号公路上,此时一个念头出现在Mullis的脑海中——扩增DNA片段时,如果同时添加两条引物,分别扩增正义链和反义链,那么只要引物足够,岂不是可以无限循环地扩增下去!

Mullis马上靠边停车,掏出纸笔开始演算。这种扩增方法,每个循环得到的DNA都是上一循环的二倍,那么循环10次DNA就能扩增1000倍,循环个30次就能达到10亿倍!

这个数字太惊人了,这个思路也太简洁了,Mullis一时之间都无法相信,之前居然从未有人尝试过。他反复查阅资料之后,在Cetus内部的科研会议上分享了自己的想法。然而奇怪的是,同事们完全不觉这有什么厉害之处。

Mullis花了几个月时间寻求认同,但赞同他观点的科学家寥寥无几,这期间他与女友的感情也出现了裂缝,直到9月,他才开始第一次实验。

如果顺利,DNA将不断以倍数扩增
在诺奖致辞中,Mullis提到他不喜欢重复劳动,如果一件事需要反复做同一个流程,那么他会倾向于写个程序来解决。所以那个夜晚,他把聚合酶加入试管后就径直回家了,满心以为DNA已经在管中自己成倍增加了。

然而第二天中午,Mullis没能在凝胶中看到期望的条带。他不得不承认,反复地加热、冷却、添加聚合酶,这枯燥的工作是绕不过去的坎儿。

接下来的三个月里,Mullis磨磨蹭蹭地进行着实验,同时为了感情问题焦头烂额。终于在飘雪的圣诞节,他终于成功实现了扩增一个pBR322质粒的一个25bp长的片段,同时也失去了爱情。

结束的开始

事情进展并不顺利。1984年中,Mullis再次在Cetus的会议上向同事汇报了自己的成果,结果依旧无人感兴趣。也是在这个会上,Mullis和另外一位同事发生了口角,上升到了肢体冲突。这个突发事件以Mullis降职、另一人离开公司结束。

Mullis的好友White此时已经当上了Cetus的技术副总裁,他帮助Mullis拉起一支小组专门研究PCR,其中有个名为才木的日本人。不知是不是日本人天性严谨又勤劳,这支小组成立后,研究很快得到了推进,他们成功扩增了一个110bp的人源蛋白基因片段。

进行了更多的尝试之后,研究者们决定撰写两篇论文,Mullis主导的一篇介绍PCR技术理论,才木主导的另一篇介绍PCR技术的应用。

出于某些原因——笔者本人相信可能是Mullis的拖延癌又犯了——当才木的论文写好时,Mullis几乎还没动笔。

在前几节我们提过,此时Cetus正把全力投在IL-2开发上,公司急于从科研公司转型到制药公司,没有时间耗费在不知能不能变现的技术上。高层没法等Mullis完成论文,便催促才木赶快先把应用论文发表。

12月,才木的论文发表在了《科学》上,题目是《β-珠蛋白基因组序列的酶促扩增和限制性位点分析诊断镰状细胞贫血》。

Mullis的论文就没那么好运了,他先后投了《自然》和《科学》,都因为内容不够“原创”被拒稿,最后不得已投了《酶学方法》,论文直到1987年才出版[14]。

同一年里,Cetus内另一组科学家也在为PCR的进化添砖加瓦。PCR最初的版本使用的是来自大肠杆菌的DNA聚合酶,这种酶不耐热,必须每个循环都重新添加,大大降低了自动化程度。

Cetus与Perkin-Elmer合作开发的热循环仪原型机,因为需要持续添加DNA聚合酶,所以采用了敞口、机械臂移动的方式
从耐热菌中分离聚合酶的想法是谁提出的不确定,最后进行这项工作的是David Gelfand和Susanna Stoffel。两位科学家在秋天从Thermus aquaticus中分离到了能够在95℃高温下依旧不失活的TaqDNA聚合酶,Taq酶马上就被应用到了PCR中。

这就是我们现在也在使用的PCR第一次完整出现。

1986年的热循环仪原型机
幻觉中的情圣

看起来PCR已经走过最艰难的时刻,是该享受光辉和荣耀的时候了。然而不知为什么,共过苦的伙伴,却很难同甘。

一方面,是PCR发明人的身份争议;另一方面,Cetus对PCR团队也着实不太公平,虽然Mullis获得了一万美元的奖金,但是团队里的其他人只是象征性地收到了一美元,这让他们与其他团队之间的分歧更大了。1986年,Mullis选择了离开Cetus。

1991年,Cetus折戟梦途;1992年,身价3亿美金的PCR专利去往新东家Hofmann-La Roche;1993年,Mullis登上诺贝尔领奖台,大谈童年时光与128号公路上的那个夜晚。

Mullis与PCR的故事其实到这里就差不多已经全部说完了。纵观他的一生,Mullis表现出很多并不那么像个德高望重的诺奖获得者的特征。

Mullis在诺贝尔获奖致辞中反复提到分手的女友,甚至表示获奖的喜悦也抵消不了失去这个姑娘的悲伤——就算那已经是十年前的事情了——表现得像个痴心的情圣,可他50岁前就结了四次婚。据称他在男女关系上确实不那么保守,也曾因此在公司内引发问题。

White把Mullis描述为一个充满创造力,但是有些过于随心所欲的角色[16]。Mullis才华横溢,而且没有对权威的畏惧,但是另一方面他并不那么自律,实验进行得断断续续,这是他无法在Cetus内部取信于人的原因之一。他俩的友谊最后没能持续下去,但在之后的舆论纷争中White一直站在Mullis的一边。

Mullis还有些不那么登得上台面的小爱好。1938年,Albert Hofmann首次合成了LSD,这种物质在十年后被引入精神疾病治疗领域,然后在短短几年时间内成了倍受年轻人喜爱的时髦小玩意儿,成为史上最有名的致幻剂[17]。Mullis上学的时候也好这一口——这是他亲口告诉Hofmann的——并且Mullis认为LSD带来的幻觉帮助他在128号公路上找到了PCR的灵感。

Mullis还有些甚至不太像科学家的地方。比如他认为HIV病毒并非AIDS的病因、全球变暖是个伪命题;他相信占星术,相信转世,还宣称自己曾与伪装成荧光浣熊的外星人对话。

还有一个有趣的细节。前文曾讲过,Kleppe1971年发在《分子生物学杂志》上的论文首次提到了修补复制的概念,也提到了双引物系统。

人类学家Paul Rainbow曾写过一本书“Making PCR:a story of biotechnology”,详细地讲了整个PCR的发现故事,书中提到,其实1969年的高登会议上,Kleppe就公开发表过这个观点,当时在场的科学家中有一位名为Stuart Linn。

巧了,这位科学家正是Mullis就读加州大学伯克利分校期间的一位老师,而Linn也的的确确曾在课堂上演示过Kleppe的设想,实验也成功了。所以Rainbow认为,Mullis可能只是个“追随者”,并非“开创者”。

Mullis是个“好人”吗?我们不知道。但是PCR,真真实实地改变了世界。

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