前 言
a) 将“总则”更改为“技术标准”,细分了原则,并将 2002 年版的有关内容精简更改后纳入(见附录,2002 年版的 11.1、11.2、11.3、11.4);
b) 调整技术标准内容框架结构,根据检测流程进行技术指标分层细化;
c) 增加了对检测项目室内质控和室间质评的技术指标参数设定(见5.6.1、5.6.2、5.6.3、5.6.4、 5.7.1、5.7.2,2002年版10.1、10.2、10.3、10.4);
d) 增加了两种新的测定方法(见5.1.1.2、5.1.1.3,2002年版8.1);
e) 增加了性能验证技术指标设定(见5.4.1、5.4.2、5.4.3、5.4.4)。
《凝血因子活性测定技术标准》
1
凝血酶原时间
血浆与凝血活酶试剂(例如,组织因子)和氯化钙反应后发生凝固所需要的时间。[来源:WS/T 359-2011,2.1]2
活化部分凝血活酶时间
血浆与适量的氯化钙(CaCl2)、部分凝血活酶试剂盒接触因子激活剂(如白陶土)反应后发生凝固所需要的时间。
[来源:WS/T 359-2011,2.2]
3
定标曲线
校准曲线
参考曲线
定量反映凝血因子活性与纤维蛋白形成所需时间之间的相互关系的曲线。4
定标血浆
校准血浆参考血浆已知凝血因子活性的枸橼酸钠抗凝的正常混合血浆,用于制备定标曲线。5
乏因子血浆
缺乏待测凝血因子的血浆。6
质控血浆
源于人或动物血,或者人工制成的新鲜、冰冻或冻干的血浆,用于质量控制。7
缓冲液
具备缓冲酸碱能力的液体,如Owrens缓冲液、咪唑缓冲液等。8
检测系统
1
标本采集
依照 WS/T 359的要求进行标本采集。选择塑料针筒或者负压采血系统,建议成年人血样采集使用19G或21G针头,婴幼儿血样采集使用22G或23G针头,静脉穿刺采血时,应规范采血流程,一次穿刺成功,尽量避免引起凝血因子激活的操作。若患者的血细胞比容异常升高(Hct≥55%),应按 WS/T 359推荐 的公式进行抗凝剂比例的调整。
2
标本运送、处理和保存
(1)标本采集后应确认无血凝块存在,采集后宜在1 h内送检,采用规定的离心速度和离心时间(室温、1500 g、不少于15 min)分离血浆,以获得乏血小板血浆(血小板计数<10 ×109/L),4 h内完成血浆标本检测。
(2)依照 WS/T 359的要求在常温下进行标本运送,标本应在采集后尽快送检(若不能及时检测,应在分离血浆后置于4℃冰箱4 h内完成检测)。冰冻血浆在-20℃条件下最多可保存2周,在-70℃条件下最多可保存6个月。(3)若使用冷藏标本,检测前应将标本于室温放置15 min~20 min使其恢复至室温。(4)若使用冰冻血浆标本,应将其置于37℃水浴快速复融至少4 min~5 min,检测前标本应充分混匀。
3
标本拒收标准
实验室应制订不合格标本的拒收标准,包括(但不限于以下内容):
a)申请单和试管标签上的信息不一致、试管条码信息错误、试管标签或试管条码脱落;
b)从标本采集到实验室接收标本的时间不符合实验室的规定;
c)当标本存在凝块、溶血、抗凝剂使用错误或采血量不当(与标示量相差超过±10%)时。
4
标本误差来源
标本误差来源包括(但不限于以下内容):
a)采血量不当(与标示量相差超过±10%);b)使用非规定的抗凝剂(如EDTA盐或草酸盐)、抗凝剂的浓度、用量不准确;c)标本有凝块、溶血、黄疸、脂血或混浊;d)标本混匀不当,混匀不充分或剧烈混匀,产生气泡等;e)采血器或贮血管不洁,或受到污染;使用非规定、不适当的标本采集管;f)血细胞比容高于或等于55%;g)急性炎症反应、纤维蛋白原升高或纤维蛋白原异常可使采用PT途径测定的凝血因子活性不准确;h)延迟检测或使用不标准的方法处理、运送及贮存测试标本。 五检验过程
1
检测系统
(1)检测方法原理a)一期法检测
基于 PT 检测的凝血因子:因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ
基于 APTT 检测的凝血因子:因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ与Ⅻ
2、检测系统选择
(1)实验室宜选用仪器与试剂配套的检测系统。使用非配套检测系统时,应确认该系统是否能满足性能验证要求。
2
试剂和耗材
(1)APTT 试剂 不同APTT试剂由于激活剂的不同而对凝血因子活性检测的敏感性存在差异。检测凝血因子缺乏时,宜选用对凝血因子缺乏有高敏感性的APTT试剂(可检出凝血因子活性<30%的标本,包括凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等)。针对怀疑存在狼疮抗凝物的标本,宜使用对磷脂不敏感的APTT试剂盒。实验室在更换APTT试剂批号时,应进行新旧试剂的比对:根据验证标本的目标水平(验证标本应尽量覆盖检测项目的可报告范围,并至少包含正常水平和异常水平)、各水平的确定临界值、不精密度值等参数来确定所需标本数,分别采用新旧试剂进行检测,计算偏差和平均偏差绝对值,并与拒绝限进行比较,判断批号间验证是否通过。
c)在运输或贮存过程中,因处置不当(如温度等因素)而导致试剂变质;
d)所用试剂超过了有效期或复溶后的稳定期。
3
定标曲线制作
(1)正常值定标曲线
采用全自动血液凝固分析仪进行凝血因子活性检测时,可按照仪器生产厂商的要求预先设定参考血浆的稀释比例并使用配套参考血浆制作定标曲线。参考血浆的稀释比例应至少包括 1/10、1/20、 1/40 和 1/80 四个水平。采用手工法或半自动血液凝固分析仪进行检测时,需根据不同比例稀释标本的 PT 或 APTT 检测结果与对应的稀释比例在半对数或双对数坐标纸上手工绘制定标曲线。(示例见附录 A)
定标曲线的线性回归方程的 r 值应在 0.998~1.000,斜率应在 0.9~1.1。
频率:对于采用手工法或半自动方法进行凝血因子活性检测时,每批次均需建立本次的定标曲线;全自动检测方法在试剂批号更换、仪器设备调整、室内质控失控等情况下需重新建立定标曲线。
4
性能验证
(1)性能验证一般要求a)新的检测系统用于临床检测前,依据厂家说明书的要求进行校准和性能验证,至少应包括批内精密度、批间精密度、正确度和可报告范围等。
b)验证周期:在更换设备、组件以及试剂时需要进行性能验证。
(2)重复性 重复性又称批内精密度,是以连续检测结果的变异系数(CV)为评价指标。重复精密度的验证方法:至少使用两个浓度水平(包含正常和异常水平)的新鲜临床标本或质控物进行检测,每个标本按常规方法重复检测 11 次,剔除第 1 次检测结果,计算后 10 次检测结果的变异系数。内源性凝血因子(APTT 途径)和外源性凝血因子(PT途径)的正常标本和异常标本的 CV 应均≤10%。
5
检测程序
(1) 标准操作程序的建立与实施 实验室应依照《医疗机构临床实验室管理办法》、本文件和仪器试剂生产厂商的操作说明制定各检测项目的标准操作程序(Standard Operation Procedure,SOP)文件,并严格按照 SOP 文件的要求进行操作。
6
室内质量控制
(1)质控血浆的选择:实验室可使用商业质控血浆或自制质控血浆(冰冻血浆)进行室内质量控制,质控血浆应至少具有 2 个浓度水平(包含正常水平和异常水平),使用自制质控血浆时应与商业质控血浆进行同步检测以评价其适用性。实验室应根据实际工作需要确定质控血浆的数量,避免质控血浆批号更换过于频繁。
7
室间质量评价
(1)实验室应参加室间质量评价机构组织开展的室间质量评价活动,以保证采用相同实验室检测系统之间结果的可比性。
8
检验结果的比对
若实验室内使用多个检测系统测定同一种分析物时,应定期进行结果比对(宜半年一次),至少使用20份临床标本(覆盖正常和低值标本)按照常规操作流程进行检测,正常浓度标本的比对偏倚应≤15%,低值浓度标本的比对偏倚应≤30%(或按照生产厂家和试剂说明书要求)。 六检验后过程
1
参考区间
对于每个凝血因子,实验室可参照文献报道的参考区间进行验证后使用。若不适用,应根据所用仪器、试剂、采血方法、主要就医人群(成人或儿童)及所用抗凝剂建立适用于本室的参考区间。参考区间以相同的单位显示在每一份报告单上。
2
报告结果
报告前,应确定待测标本检测结果已乘以相应的稀释倍数,采用不同稀释比例测定值的平均值作为报告结果。报告单位为活性%或 IU/mL 均可,但需在检验报告中统一规范凝血因子活性报告单位及格式。超出定标曲线值以外的结果亦可报告以大于或小于相应的可读值报告,但应与临床联系,共同确定其原因。举例说明请见附录 B。
3
结果判读误差的来源
可能的结果判读误差来源包括(但不限于以下内容):a)未辨认出两条曲线缺乏平行;b)未辨认出两条曲线缺乏线性;c)采用推断的方法得到定标曲线范围之外的数据。
附 录 A
(资料性)
定标曲线手工绘制
采用手工法或部分半自动血液凝固分析仪进行检测时,需根据不同比例稀释标本的PT或APTT检测与 对应的稀释比例在半对数或双对数坐标纸上手工绘制定标曲线,图应形成“S”型曲线,两端扁平,中 间呈线性(图A.1,图A.2)。线性区计算所得r值应在 0.998~1.000、斜率应在 0.9~1.1 范围内。
附 录 B
(资料性)
结果解读
待测血浆标本经三点稀释后形成的标本结果曲线应形成一条与工作定标曲线平行的直线。 若以上的情况不存在,应该考虑以下可能性:
a)若两个或更多邻近点形成一条平行于定标曲线的直线,但没有实验结果落在可读范围之内,进一 步稀释参考血浆或受检血浆则可能产生可读结果(见图B.1);
b) 若仅一个试验结果落在可读范围,同时与邻近点形成的直线不平行于定标曲线,则应稀释受检 血浆,以便获得可读结果;
c) 若受检血浆与参考血浆曲线不呈平行,而一个以上的结果落在已知的线性范围内,则应当怀疑 标本中有抑制物存在(见图B.2)。在报告结果时,以最高稀释度报告,同时应说明标本中可能有抑制物, 应做有关检查确定;
d) 若所有的实验结果均落在线性范围之外,同时出现类似的试验结果(不考虑稀释所造成影响), 这个现象提示所有的试验结果均位于“S”曲线的平台区。这是典型的严重凝血因子缺乏状态(见图B.2)。
这种情况,应采用低值定标曲线进行测定,并且要求对标本进行两次测定。若患者血浆的凝固时间 更延长,则患者结果可以低于该凝血因子检测最低限。
【参考文献】
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上述标准自2022年1月1日起施行,WS/T 220—2002同时废止。
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