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Cytiva 思拓凡:血液保存的优良载体

2021/7/14 13:56:54 浏览次数:529
2021年5月31日,中共中央政治局召开会议并指出,进一步优生优育政策,实施一对夫妻可以生育三个子女政策及配套支持措施,有利于改善我国人口结构、落实积极应对人口老龄化国家战略、保持我国人力资源禀赋优势,因而新生儿疾病筛查工作也势必会成为了各医院机构的重点工作。


新生儿疾病筛查(Newborn screening, NBS)是指在新生儿群体中用快速、简便、敏感的检验方法,对危及儿童生命、危害儿童生长发育、导致儿童残疾的先天性或遗传性疾病进行筛查,使患儿在临床症状出现前及早诊断和治疗从而避免智能和体格发育的不可逆损害和疾病性伤残,也是降低新生儿出生缺陷的第3级预防措施,对提高优生优育、提高人口素质,减少和降低儿童体格智力发育缺陷具有重要意义。


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NBS现在已成为许多国家新生儿护理的常规组成部分,早期主要对新生儿进行遗传代谢疾病(IMDs)和其他常见遗传疾病的筛查。近年随着研究的不断深入,一些罕见的疾病也先后被列入NBS项目,如新生儿葡糖脑苷脂病[1]、囊包性纤维症[2]、镰状细胞贫血[3]、婴儿感染免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)早期诊断[4]和静止性α地中海贫血[5]等。NBS的检测方法也具有多样性(https://xueqiu.com/1912517390/159311851),如串联质谱(MS/MS)是目前发达国家检测生化代谢产物的主要方法,被广泛用于检测干血斑(DBS)中与氨基酸代谢、有机酸代谢和脂肪酸氧化相关的代谢产物。在中国,除了MS / MS外,普通的生化检测方式如酶免也经常被用于高苯丙氨酸血症的苯丙氨酸(Phe)测试,甲亢或甲状腺功能减退的甲状腺刺激激素(TSH)测试(http://www.clinicalms.com.cn/apply_show/332.aspx)。在过去的十几年中,分子生物学方法也已被证明是检测新生儿重大疾病如SCID和遗传疾病的有效方法,前期诸多研究结果表明可以从DBS中提取有效的DNA用于PCR和NGS。2005年,Chan和Puck发表了一种使用实时定量PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)检测新生儿疾病DBS中TREC含量的方法来发现重症联合免疫缺陷病(Severe Combined Immunodeficiency,SCID)。2009年,Massachusetts采用内部控制多通路实时qPCR TREC试验进行SCID NBS预试验项目。从此美国和全球其他NBS项目已经将SCID引入到它们的常规筛查中,并且更多的NBS项目正在努力获得实施(新生儿重症联合免疫缺陷病的筛查 )。近期,上海新华医院余永国教授团队的最新文章也证明NGS和生化筛查相结合可以提高目前NBS的效率[6,7]


干血斑法在新生儿样本采集中的应用


干血斑法(Dried Blood Spots, DBS)用于进行新生儿疾病筛查(Newborn screening, NBS)最早可以追溯到1963年,Robert Guthrie博士使用采血卡DBS标本进行苯丙氨酸分析并成功的鉴定了苯丙酮尿症的新生儿[8],1975年,干血滤纸片采血法用于先天性甲状腺功能减低症(congenital hypothyroid ism, CH)的筛查并且获得成功,此后以DBS采样方式为主的新生儿疾病筛查在欧美等发达国家迅速开展并逐步普及至越来越多的国家。与传统的静脉采血相比,DBS采样方法优异性不言而喻,如血样采集过程的简化;采血量小,对身体的侵害性小;几乎没有生物危害;干燥后的血样可在室温下存储和运输一定时间,适用于冷链资源有限的地区。除此之外,根据在各个国家或者州法规的规定(https://babysfirsttest.org/newborn-screening/what-happens-to-the-blood-sample),在完成新生儿筛查后,通常新生儿的血样会被留存或者保留一段时间再被销毁,此时DBS技术可以帮助实验室有效的节省存储空间。


干血样品的制备及处理


一、血液采集  DBS,又称微量滤纸全血测定法,是使用一次性采血针或毛细管从指间或足跟采血后滴在预先规定好体积的滤纸上。


二、血液干燥  样品采集后需对其进行干燥。对于采用DBS取样的样品,通常推荐在室温(15 ~22℃ )通风条件下,至少干燥4 h ,具体的干燥时间需要根据滤纸的类型以及取血体积来决定。


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三、干血样品的处理 


1、干血样品的运输、储存。DBS应该储存在含干燥剂,湿度指示剂和较少气体的透明袋中。当多个DBS储存在相同的容器中时,应该用实验室称重纸或半透明纸隔开,以防止可能的交叉污染。DBS能够满足患者在家远程取血的要求,因此,在送达实验室分析前需考虑储存、运输过程中样本的稳定性。已经有大量的研究验证了在DBS采血法条件下化合物的稳定性,中国疾病预防控制中心模拟性能力评估调查(MPES)的结果表明DBS中的TREC至少能够储存在4℃~-20℃含干燥剂的环境下24个月(新生儿重症联合免疫缺陷病的筛查 (360doc.cn))。


2、干血样品的提取。样品的提取分为离线提取和在线提取。离线提取的程序通常是加入一定量的含有内标物质的提取溶剂(用含 0.05% Tween 20 和 0.08% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水填充孔。使添加的缓冲液的体积适应用于干血斑洗脱液后续分析的最低检测要求)。研究人员提出了样品的在线提取,该方法基于“耐氏细胞”结构,分析物从纸张上解析,然后被整合到LCMS系统中,转向柱切换系统,以确保用于MS检测的待测物的纯化和分离[9]



Whatman 903(W-903)卡


在DBS测试的历史中, 许多不同的滤纸卡已经使用了,但是至今只有两个商业来源被FDA批准为医疗器械,用于采血。其中一款就是Whatman 903卡。


Whatman 903(W-903)是目前唯一用于HIV载量和HIV耐药性检测的卡[10]。W-903(通用型)是一种以植物纤维为载体用于存储DNA的新型介质,专为室温下各种生物体液(如血液、唾液等)、细胞培养液、微生物、植物组织和病毒等样品进行收集、运输和存储而设计。通过独特的配方和生产工艺是该产品同时具有抑制细菌生长的功能,从而保证该DNA在该存储卡上存储一年也不降低PCR效率,并且由于蛋白质的变性使得生物样品中的致病微生物或病毒丧失活性,避免了对操作人员的污染危险,同时也保证了长途运输的安全。


W-903技术参数

规格

克重

170-188g/m2

厚度

0.5mm±0.01mm

灰分

0.1%±0.001%

组装环境

洁净车间,10万级,相对湿度30%-50%

有效使用面积

≥4.5*2.5cm2

血斑直径

15-17mm/100ul

血液吸收时间

5-30s/100ul

保存条件

15—30℃


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DBS技术的应用展望


关于DBS应用的报道持续增加,表明了这一新型采血方法的应用及发展已经引起了各领域极大的关注。DBS简化了的血液收集过程,消除了很多传统静脉采血的弊端,节约了时间和经济成本。然而,它的优势必须要与采样方法引入的潜在误差程度相权衡。RHODEN等将DBS运用于丙戊酸的治疗药物监测时,考察了丙戊酸在干血斑和血浆中的浓度比,发现血细胞比容( hematocrit, HCT)对浓度比有很大的影响。HCT决定了血液的黏度。当采用DBS采样时,血液黏度影响血液在采样卡的圆圈内扩散,从而影响干血斑的大小[11]。除此之外,DBS的结果容易受色谱效应、冲孔位置和点血体积等因素的影响[12]。在对这些因素进行校正的同时还需要建立更多的标准,做更多的基础研究,开发更多的分析方法来准确定量分析物。


DBS的技术正在一步步地完善,并不断地开发着新的技术以使这项采血方法更加易于使用,更加简单。同时,DBS的使用已从其在新生儿筛查诊断领域的适度开始扩展到药物开发,包括发现研究,非临床和临床毒物和药代动力学评估以及治疗药物监测。DBS存在着巨大的潜力,并且随着科技水平地不断发展,最终会给患者的疾病诊疗带来更大的收益。


Cytiva成立于2020年4月,作为全球生命科学领域的先行者,Cytiva致力于促进与加速全球医疗的发展。而Whatman作为Cytiva重要的产品品牌之一,至今已有280多年的历史,并以其高质量,高可靠性和容易操作在实验室中赢得广泛赞誉。Whatman不断寻求简单理念,致力于让科学发现更迅速、成本更节约、时间消耗更少,其一系列产品为生命科学探索注入了强劲动力。除了拥有Whatman实验室过滤产品外,Cytiva还拥有ÄKTA蛋白层析系统,ÄKTA flux 过滤系统,Wave波浪式一次性生物反应器,Sera-Mag磁珠以及HyClone培养基等品牌设备及耗材产品,可广泛应用在生物医药、诊断治疗等领域,全力推进疾病预防及诊疗的发展进程。


参考文献

[1]WOLF P, ALCALAY R N, LIONG C, et al. Tandem mass spectrometry assay of β-glucocerebrosidase activity in dried blood spotseliminates false positives detected in fluorescence assay[J]. MolGenet Metab, 2018, 123( 2) : 135.

[2]LEFTEROVA M I, SHEN P, ODEGAARD J I, et al. Next-generation molecular testing of newborn dried blood spots for cystic fibrosis[J]. J Mol Diagn, 2016, 18( 2) : 267.[3]MOAT S J, REES D, KING L, et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease[J]. Clin Chem, 2014, 60( 2) : 373.[4]张飞, 牟鸿江, 黄太华. 贵州省 2015 - 2016 年婴儿感染 HIV早期诊断情况分析[J]. 中国艾滋病性病, 2018, 24( 11) : 1159.[5]杨金玲, 陈大宇, 黄丽华, 等. 毛细管电泳技术在新生儿静止型α 地中海贫血筛查中的应用[J]. 中国优生与遗传杂志, 2018,26( 01) : 81[6]Luo X, Wang R, Fan Y, et al. Next-generation sequencing as a second-tier diagnostic test for newborn screening. J Pediatr Endocrinol Metab 2018;31:927-31.[7]Luo X, Y Sun, Xu F, et al. A pilot study of expanded newborn screening for 573 genes related to severe inherited disorders in China: results from 1,127 newborns[J]. Annals of Translational Medicine, 2020, 8(17):1058-1058.[8]GUTHRIE R, SUSI A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of new born infants[J]. Pediatrics, 1963, 32( 3) : 338.[9]周利娟, 汪硕闻, 石卫峰,等. 干血法及其临床应用进展[J]. 中国临床药学杂志, 2019, 028(004):312-316.[10]Rottinghaus E ,  Bile E ,  Modukanele M , et al. Comparison of Ahlstrom grade 226, Munktell TFN, and Whatman 903 filter papers for dried blood spot specimen collection and subsequent HIV-1 load and drug resistance genotyping analysis[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2013, 51(1):55-60.[11]RHODEN L, ANTUNES M V, HIDALGO P, et al. Simple procedure for determination of valproic acid in dried blood spots by gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal, 2014, 96( 15) : 207.[12]M O’Mara, Hudson-Curtis B, Olson K, et al. The effect of hematocrit and punch location on assay bias during quantitative bioanalysis of dried blood spot samples[J]. Bioanalysis, 2011, 3(20):2335-2347.




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