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新冠居家检测试剂盒问世,核酸快检方法有哪些?

2020/12/3 17:22:33 浏览次数:1593

美国当地时间11月17日, FDA发布紧急使用授权(EUA),首批可提供快速检测结果的“新冠居家自检测试盒”!30分钟内即可鉴定自己是否感染新冠病毒。而后,12月1日,国内CRISPR免疫层析法新冠病毒检测试剂盒获批,盘点后疫情时代新冠核酸快检方法有哪些?


截至2020年12月2日,全球累计新冠确诊病例超过6284万例,累计死亡病例超过146万,11月以来,全球单日新增新冠确诊病例连创新高。约翰斯·霍普金斯大学统计数据显示,全球累计确诊病例10月19日超过4000万例,11月8日超过5000万例,从4000万例升至5000万例耗时20天,从5000万例升至6000万例耗时仅17天。北半球随着天气渐渐转冷,确诊病例的增长速度加快。

那么,减少人员流动以降低感染风险,同时减轻医检单位的压力,核酸快检或将成为最有效的新冠检测方式之一。


LAMP技术


盘点核酸快检方法,RT-LAMP或是最快捷,成本最低的方法了。2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术,即环介导等温扩增技术英文名称为“Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)”。BST DNA聚合酶是该技术的关键酶,利用其强的链置换活性和DNA聚合活性,在恒温条件下,快速、高效、特异性的扩增模板,并且由于DNA扩增过程中产生的焦磷酸盐形成白色沉淀而使反应结果可视化。


目前,该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等病毒疾病的检测中。此次美国快批上市的新冠居家自检试剂盒就是利用该技术。


LAMP技术的优点:灵敏度高,相较于传统PCR方法高2~5个数量级;反应时间短,可30~60分钟完成反应;临床使用不需要特殊的仪器;操作简单,所有组分集于一管,置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温即可,肉眼可直接观察检测结果。


近岸蛋白质提供以下LAMP产品


针对DNA或RNA病毒类型,LAMP方法均可达到理想的检测结果。近岸蛋白质BST 2.0及RT-LAMP试剂经过多方验证,能够高产扩增极低量DNA、RNA。



更有超灵敏指示剂式RT-LAMP mix,可检测低至1fg级别RNA样本。



CRISPR技术


21世纪,CRISPR技术可谓是最火的生物技术之一,今年10月刚刚颁布的诺贝尔化学奖给到两位先驱人物埃马纽尔·夏彭蒂耶和詹妮弗·杜德纳以表彰她们在基因编辑技术的贡献更是证明了这一点。该技术最初是根据古细菌的自我保护机制开发,利用Cas相关蛋白编辑切除非我基因以达到对入侵者的杀伤作用。近几年CRISPR/Cas9基因编辑技术也日趋成熟,已经开始走进人类疾病治疗中。Cas系列蛋白的深度开发中,Cas12、Cas13和Cas14的发现,让CRISPR技术应用于诊断成为可能。它们普遍存在第二个酶活结构域,当蛋白正确结合并切割特定核酸序列后,能够激活这一结构域,切割报告分子,实现从待检序列信息到可检测信号的转化。


Cas13a

2017年4月,张锋团队在SCIENCE上发表文章,阐述了将Cas13a与等温扩增结合,建立了一种基于CRISPR的诊断方法(CRISPR-Dx),提供具有attomolar级别敏感性和单碱基错配特异性的快速DNA或RNA检测。该研究使用这个基于cas13a的分子检测平台(Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing, SHERLOCK)来检测寨卡病毒和登革热病毒的特定菌株,区分致病菌、人类基因型DNA,并识别无细胞肿瘤DNA的突变。


Cas13d

2018年,Salk生物研究所和Arbor Biotechnologies公司(张锋是创始人之一)的研究人员通过常用的生物信息学筛选,在推定的效应核酸酶附近寻找CRISPR重复序列,鉴定出Cas13d蛋白并报道了Cas13d的详细分子结构。


Cas12a

2018年4月,Jennifer Doudna团队在SCIENCE上发表文章,阐述了将Cas12a与等温扩增结合,建立了一种DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter (DETECTR)的方法,达到了DNA检测的最高灵敏度。DETECTR能够在患者样本中快速、特异地检测到人乳头瘤病毒(HPV),从而为分子诊断提供了一个简单的平台。



近岸蛋白质提供以下
CRISPR诊断蛋白


Cas12a

Cas12a切割dsDNA活性

Cas12a切割ssDNA活性

Cas13a

LwCas13a切割效率

Cas13d

UrCas13d切割效率



TMA技术



同样为恒温扩增技术的还有转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA),该技术由Gen-Prob研发,利用T7 RNA聚合酶和逆转录酶在约42℃等温反应条件下扩增样本。其原理是逆转录酶利用带有T7启动子的引物将RNA样本逆转录成cDNA,然后RNaseH将cDNA-RNA杂链中RNA消化后,T7 RNA聚合酶可将含有T7启动子的cDNA转录成RNA,一分子DNA模板转录得到100-1000拷贝的RNA,而这些RNA又再次进入反应成为TMA的起始模板。如此循环,RNA称指数增长,在15-30min内将靶序列扩增1010左右。



与LAMP及PCR技术相比,TMA最大的优势在于不会产生假阳性,其次是扩增效率高,易于实现自动化。


近岸蛋白质经过系列优化调整,完成了TMA的实时荧光检测,对RNA模板进行梯度稀释后进行TMA扩增,结果可对0.1pg RNA实现有效扩增。




进入冬天开始,纵观国内外疫情,当前国内暂时呈现小范围零星确诊,国外氛围依旧紧张,我们未来面对的压力只会越来越大,“新冠居家自检测试盒”的上市在当前情况下,无疑为大家提供了一套安全、便捷的检测系统,未来在实现全民免疫之前,居家检测或将成为人们快速自检的新方式。


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近岸蛋白质是一家专业从事靶点蛋白、细胞因子、分子试剂和诊断原料研发生产及抗体药CRO服务的高新技术企业。公司自研并生产16000余种产品,涵盖抗体药、细胞治疗、IVD、NGS、基因编辑等多个领域;并提供差异化抗原开发-噬菌体建库-高通量候选分子筛选-人源化与亲和力成熟-快速重组表达与表征等一站式抗体药物开发服务。


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